Microscopie à fluorescence

La microscopie en fluorescence (ou en épifluorescence) est une technique utilisant un microscope optique en tirant profit du phénomène de fluorescence et de phosphorescence, au lieu de, ou en plus de l'observation classique par réflexion ou absorption de la lumière visible naturelle ou artificielle. On peut ainsi observer divers objets, substances (organiques ou inorganiques) ou échantillons d'organismes morts ou vivants. Elle fait désormais partie des méthodes de recherche classiques et de la biologie et continue à se développer avec l'. La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de cette lumière émise. Le déplacement de Stokes décrit la différence entre la longueur d'onde absorbée par l'objet (émise par la source lumineuse du microscope) et émise par l'objet. Plus la différence entre les deux longueurs d'onde est grande plus il est facile d'observer la fluorescence. fluorescence En fluorescence on distingue deux types d'objets : les premiers émettent de la lumière fluorescente par eux-mêmes, on parle de « fluorescence primaire » ou autofluorescence (chlorophylle, huile...) ; les autres doivent être combinés à une substance fluorescente pour émettre de la fluorescence on parle donc de « fluorescence secondaire ». En microscopie de fluorescence, on peut donc visualiser directement des substances fluorescentes. Pour des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes, il est nécessaire de les marquer par des substances appelées fluorochromes, comme le DAPI qui marque l'ADN et fluoresce en bleu. Certains marqueurs génétiques comme la protéine fluorescente verte, (en anglais Green Fluorescent Protein ou GFP) sont aussi très utilisés en biologie dans des organismes génétiquement modifiés pour en produire de manière endogène. Dans ce cas, le fluorochrome est une protéine produite directement par la cellule elle-même et ne nécessite pas l'ajout de substrat.